Использование внутреннего стандарта для количественного определения флавоноидов
При анализе субстанций и готовых лекарственных форм методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) одним из основных вопросов остаётся вопрос стандарта. Особенной проблемой является анализ субстанций данным методом, так как для него следует использовать государственный стандартный образец (ГСО), либо стандарт согласно фармакопеям других стран.
ВЭЖХ на сегодняшний день допускает применение методов внутреннего и внешнего стандартов, и метод добавок. Государственная фармакопея РФ не описывает предпочтение метода стандарта. Следовательно, выбор способа введения стандарта выбирается автором методики и доказывается валидацией методики количественного определения.
Если выбор методики производят для одного химически полученного действующего вещества, то наиболее рационально использовать внешний стандарт. Поэтому большая часть методик, приведённых для количественного определения лекарственных средств, основана на внешнем стандарте.
В случае анализа субстанции, являющейся суммой нескольких действующих веществ, выбор внешнего стандарта затрудняет анализ. Например, традиционно флавоноиды в лекарственном растительном сырье определяют с помощью отношения площадей пиков агликонов с соответствующими агликонами-внешними стандартами.
В случае стандартизации готовой лекарственной формы данный подход может быть излишним. Из-за сходства структур агликонов флавоноидов можно предложить одно вещество, использование которого в качестве внутреннего стандарта позволит сократить затраты (в том числе времени), необходимые для одного анализа.
Нами рассматривалась возможность использования общего стандарта для количественного определения суммы флавоноидов для стандартизации выбранной ранее смеси экстракта гинкго и винпоцетина. Особенностью данной работы являлся поиск стандарта одновременно для анализа агликонов флавоноидов и винпоцетина.
В ходе изучения УФ-спектров соединений - кандидатов во внутренний стандарт и сравнения их со спектральными свойствами винпоцетина и флавоноидов был выбран в качестве внутреннего стандарта дротаверина гидрохлорид.
Параллельно была выбрана совместная методика пробоподготовки. Исходя из проведённых опытов, можно обобщить первый этап подготовки образцов для анализа винпоцетина и суммы флавоноидов. Извлечение в обоих анализах готовится на смеси спирта этилового (или изопропилового) с кислотой соляной. Причем если для винпоцетина кислая среда способствует полноте извлечения, то для флавоноидов служит реагентом в последующем гидролизе. Также оба анализа могут быть проведены с использованием одного и того же стандарта – дротаверина. Поэтому можно разработать общую тактику пробоподготовки таким образом, чтобы сократить суммарное количество процедур для анализа формы по обоим показателям (содержанию винпоцетина и сумме флавоноидов).
Помимо уже известных характеристик анализируемых веществ и стандартов для разработки тактики пробоподготовки, необходимо учитывать возможную неопределённость анализа, связанную прежде всего с использованием подходящей мерной посуды и точностью навесок. Принимая во внимание тот факт, что достаточная точность взвешивания достигается при нагрузке не менее 200 мг, создали следующую тактику пробоподготовки (рис. 1).
Рисунок 1. Схема подготовки проб для анализа а) винпоцетина и б) суммы флавоноидов. Цилиндрами обозначены мерные колбы.
Особенностью подготовки пробы было внесение аликвоты раствора стандарта в первый раствор до доведения его до заданного объёма 50 мл. После приготовления первого раствора 5,0 мл разводили до 25 мл тем же растворителем и анализировали по средствам ВЭЖХ-УФ для определения содержания винпоцетина. Оставшийся раствор подвергали нагреванию в течение 2 часов при 90°С. Из пробы после гидролиза отбирали 5 мл и разводили до 25 мл. Полученный раствор анализировали ВЭЖХ-УФ для определения количества флавоноидов.
Во время растворения навески модельной смеси, имитирующей состав готовой таблетки, возникла необходимость добавления стадии фильтрации для устранения нерастворимых в смеси соляной кислоты и изопропанола вспомогательных веществ.
Дальнейшее количественное определение проводили с использованием условий, указанных ниже (табл. 1).
Таблица 1
Режимы хроматографического разделения для винпоцетина и агликонов флавоноидов
| Показатель | Определяемый компонент | |
| Винпоцетин | Агликоны флаваноидов | |
| Режим | Изократический | |
| Состав подвижной фазы | Ацетонитрил: фосфатный буфер 45:55 | Ацетонитрил: фосфатный буфер 35:65 |
| Детектирование | 218, 254 и 280 нм | 254, 360 и 370 нм |
| Колонка | Agilent Zorbax XDB C18 150×4.6 5µм | |
| Температура колонки | 35°С | |
Пригодность предложенной схемы пробоподготовки и всей совокупности как методики для стандартизации проверялась в ходе экспериментов для установления метрологических характеристик (табл. 2).
Таблица 2
Сравнение метрологических характеристик предложенной методики и опубликованной в научной литературе
| Метрологические характеристики | Разработанная методика | Литературные данные | ||
| Винпоцетин | Флавоноиды | Винпоцетин | Флавоноиды | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Длина волны детектирования, нм | 254 | 370 | 311 | 360 |
| Воспроизводимость, % | ---- | --- | Внутридневная 100,2-104,7 | 95% для кверцетина, 80% для кемпферола |
| Междневная 93,6-107,0 | --- | Междневная 100,1-106,3 | ||
| Правильность, % | 94,8-105.2 | ---- | 87,3-93,2 | |
| СКО, % | 1,10 | Кверцетин -4,04, изорамнетин – 0,33, кемпферол -1,03 | 3,38 | --- |
| Линейность, R^2 | 0,996 | 0,931 | 0,9998 | 0,999 |
| Диапазон концентраций с линейным откликом | 68,6-92,4 мкг/мл | 0,12-0,14 мг/мл | 2,4 до 240 нг/мл | ---- |
Таким образом, используя общую методику пробоподготовки, удалось оптимизировать количественное определение готовой лекарственной формы таблетки, содержащей винпоцетин и экстракт гинкго.
Александр Петров,
доктор фармацевтических наук, профессор,
ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет Минздрава России»
Евгений Сысуев,
начальник отдела оценки соответствия ФБУ «УРАЛТЕСТ»,
кандидат фармацевтических наук, доцент
Наталья Словеснова,
магистр химии, ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет Минздрава России»
